肿瘤是生物体细胞正常生长失去控制的结果。肿瘤细胞生长速度的快慢与细胞增殖比率的大小、增殖周期的长短以及细胞丢失的数量多少有关。过去认为,肿瘤的生长是由于肿瘤细胞的迅速增殖所形成的,但通过对细胞增殖周期的研究,发现绝大多数肿瘤细胞的增殖周期和它相应的正常细胞是相同的,甚至还较长。肿瘤之所以生长的一个原因是肿瘤细胞中处于G ₀期的细胞很少,它比正常组织有较多的细胞参加增殖周期;另一原因是肿瘤细胞增殖的无限制性。细胞精确的自我复制是其生活史的重要组成部分,复制的高保真性对于生物及物种的繁衍生息至关重要。细胞周期调控的分子机制是高度有序的,并在进化和分化中有很强的保守性。目前,对其调控机制的揭示仅处于起步阶段,但有一点是明确的,调控需要多种胞内和胞外信号的共同参与。在进化或分化的进程中,尽管细胞分裂时会发生一些精细的遗传或非遗传变化,但是这些变化必须是有序的、并在受到严格控制的方式下进行,以免造成灾难性的后果。

如果细胞增殖缺乏保真性,将会导致细胞遗传不稳定,这是高等真核生物细胞发生恶变的重要因素。因此,癌症被认为是细胞生长和增殖的调控异常就不足为奇了。

肿瘤细胞增殖过程(即细胞周期)是指处于增殖的细胞完成一次有丝分裂所经历的整个连续过程。按顺序可分为G ₁期、S期、G ₂期和M期四个阶段。在一个分裂的细胞群中,细胞分裂增殖成为遗传性状相同的子代细胞需要经历两个功能阶段和两个准备阶段。功能分阶段包括S期和M期。在S期,DNA自我复制,又称为DNA合成期;在M期,两套染色体平均分配到子细胞中,称为有丝分裂期。准备阶段包括G ₁期和G ₂期。G ₁期(gap1)为S期作准备,G ₂期(gap2)为M期作准备,目前对G ₂期的了解还不够多。非增殖细胞是脱离细胞周期的终极分化细胞,或是暂时脱离细胞周期处于休眠状态,称G ₀期。细胞周期的各期运转是有序的,即一些生化事件的开始,必须在另一些生化事件完成后进行。细胞周期的有序运转受胞内一系列不甚明了的机制调控,还受胞外因素影响,如生长因子、有丝分裂原、抗有丝分裂原、分化诱导剂、细胞间接触或锚定因子以及相关营养等等。

即使是简单的单细胞生物,为适应个体及种族生存的需要,也需要对细胞周期进行控制,从而决定是否开始新的分裂。在细胞周期中有两个最为基本的调控点,一个位于G ₁期与S期的过渡时期,决定着是否进入细胞周期;另一个位于G ₂期与M期之间,又叫G ₂/M过渡点,此点决定着细胞立即进入M期完成有丝分裂或是停止一段时间。研究表明,一些基因及其产物,如细胞分裂周期基因、细胞周期蛋白以及某些生长因子、激素等,是细胞周期调控中的重要因子;同时,它们本身又受到细胞内外诸因素在多层次的调控,从而完成对细胞周期过程的控制。其中对细胞周期不同过渡阶段的协调控制是通过一系列酶活性的改变而实现的,如细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。这些酶的活性形式为细胞周期阶段特异性蛋白,即细胞周期蛋白(cyclin)和其他蛋白,如PCNA(增殖细胞核抗原)和CDK抑制蛋白组成的复合体。其基本观点是,一旦某种激酶激活细胞周期正常进行所需的蛋白质,则细胞周期即发生从一阶段向另一阶段的过渡。虽然细胞周期调控机制的许多基本要领来源于低等的真核生物,如酵母菌,但哺乳动物细胞的基本调控机制与之相似,这也将成为讨论的焦点。

CDK活性至少受6个环节调控。其中一个调控环节是细胞周期不同阶段特异cyclin的合成,如G ₁期的cyclin D和cyclin E、S期和G ₂期的cyclin A、G ₂期和M期cyclin B。另一调控环节是对cyclin降解的调控。cyclin可与CDK形成复合物,CDK可被CAK(CDK活化激酶)激活,活化的CDK可对多种细胞周期所必需的蛋白进行磷酸化。调控CDK活性的附加环节包括活性CDK中的ATP结合位点:14位苏氨酸(Thr ¹⁴)、15位酪氨酸(Tyr ¹⁵)上的磷酸化失活,或磷酸酶使上述磷酸化位点去磷酸化,使CDK复活。另外,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白可以阻止cyclin/CDK复合体的组装,或抑制CDK的激活。细胞周期各阶段的过渡有细微的差别。

G ₁期是指从有丝分裂完成到DNA复制开始之前的一段时间,又称复制前期或合成前期。这期细胞的主要活动被视为DNA的复制及蛋白质的合成做准备,产生了 cGMP、cAMP、RNA、多胺、胸苷激酶及脱氧核苷酸等物质。一旦准备就绪,在诱导因子作用下,细胞进入S期。G ₁期是细胞周期中最长的阶段,最长者可达数月之久,所以对该期调控特征的了解比其他各期更为清楚。G ₁期有一个称为限制点(R点)的阶段,经此阶段后,细胞进入S期。一旦经过R点,有丝分裂原就不再对完成DNA合成起作用。细胞DNA通常在经过R点约1～3小时后开始合成,R点的划分有助于讨论发生在G ₁早期(R前)或G ₁晚期(R后)的事件。

有丝分裂原可刺激细胞从静息期进入细胞周期,可刺激D型cyclin(cyclin D1、D2和D3)表达,只要有生长因子存在,cyclin D在G ₁期就全程表达。活化的cyclin D/CDK4或cyclin D/CDK6复合体可使视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)磷酸化。在R位点或其附近,pRb的磷酸化可解除pRb抑制生长的功能,释放与之结合的转录因子E2F。E2F可激活进入S期所必需的基因转录。

控制细胞通过G ₁期的不仅是cyclin D的复合体,cyclin E是哺乳动物G ₁期的另一种细胞周期蛋白,它的合成晚于D型cyclin,峰值浓度出现在G ₁晚期。调节cyclin E水平的信号还不清楚,它与催化亚基CDK2有关。与cyclin D复合体一样,cyclin E/CDK2复合体只有被CAK激活才有酶活性。活化的cyclin E/CDK2复合体在G ₁晚期可使pRb磷酸化,也可能使进入S期所需的其他关键底物磷酸化。

其中pRb关键蛋白和pRb相关蛋白有两种,即p107和p130,尽管它们在细胞周期中的作用不如pRb显著,但也是很重要的底物。通过对pRb、p107和p130蛋白可结合转录因子E2F家族的观察,总结出这些蛋白磷酸化对细胞周期影响的流行模型。E2F家族至少含有5种不同转录因子(E2F-1到E2F-5)。E2F在与其相关转录因子DP-1、2或3组成异源二聚体时被激活。此种异源二聚体可与特定的DNA序列结合,并活化进入S期所必需的基因的转录。E2F活性在细胞周期中的重要性充分体现在:即使在胞外或胞内有抑制信号时,强制性E2F-1过度表达仍可使细胞进入S期。G ₁晚期,E2F复合体激活基因产物,其中包括大量在S期有明显功能的蛋白质。

S期,即DNA合成期或复制期,是DNA自我复制的时期。从G ₁末期到S初期,细胞内急剧合成聚合酶及四种脱氧核苷酸。在S期,RNA聚合酶也很活跃,RNA量增加一倍,RNA和RNA聚合酶与DNA的合成有密切关系,若RNA合成受阻时,DNA复制也受阻。细胞进入S期的主要任务是在数小时内,精确地复制一套超过30亿个碱基的人基因组序列。另外,每一DNA序列在细胞周期中只复制一次。参与DNA复制的酶称为DNA聚合酶。虽然DNA聚合酶有高度保真性,但也不是完美无缺的。大约每10 ⁵到10 ⁶个核苷酸可以出现一个错配。一次细胞分裂将产生1000到10 000个突变,这会产生严重的问题。但DNA聚合酶具有校正功能,以防止DNA复制产生不良后果。错误加入的核苷酸被其3'、5'核酸外切酶活性校正切除,使错误率降低至1/1000左右。另外,细胞内的DNA修复系统可以切除并修复错配的碱基,使每次DNA复制过程的错误率更低。错配修复机制的缺陷,是某些人易患癌症的原因之一。

在复制子启动后,DNA复制的第二个有机组成是DNA链的延伸。因为DNA是双螺旋结构,两条单链必须同时复制。这一生化过程导致非对称性DNA合成,一条DNA链的复制是连续的(前导链),另一条是不连续的(滞后链)。这一步骤的细节不在本章讨论范围之内,可以参考有关著作。通过体外(in vitro)DNA复制模型发现,在真核细胞的复制叉上有很多DNA合成所需的蛋白,包括PCNA、RPA、RFC、DNA聚合酶、DNA引发酶和RNase H。这一步骤中的某些机制已经清楚。

现在认为,真核细胞是通过称作端粒的特殊结构来解决末端复制问题。真核生物染色体在其末端有富含GC的简单串联的重复序列(端粒),可作为端粒酶的模板,端粒酶能通过延长端粒来解决染色体末端复制不完全的问题。细胞内只要有活性的端粒酶,细胞就能进行无限次的DNA复制及分裂。然而,如果端粒酶的活性消失,细胞将只能复制有限的几次,因为细胞分裂可导致染色体端粒缩短,逐渐累加导致重要DNA序列丢失,终止细胞复制。通常认为在体细胞内,端粒酶活性的自我丧失导致细胞老化。肿瘤细胞可能是通过端粒酶异常地表达而表现出永生性和无限制生长性。端粒酶的激活在肿瘤发生中起关键作用,这为癌症治疗提供了新的肿瘤特异性作用位点。

DNA复制完成到丝状分裂开始的一段间隙时间,又称复制后期。在这期内有活跃的RNA和蛋白质的合成,为M期的细胞分裂做准备。

在有丝分裂过程中,除了物质准备外,尚需能量的准备,因为在分裂的过程中,许多细胞结构都处于剧烈的运动之中,能量消耗必不可少,若分裂前抑制细胞呼吸或氧化磷酸化,则分裂受到抑制。

细胞成功地完成了全部基因组的复制后,细胞复制的另一重要功能是将复制的两套基因组平均分配到子代细胞中去。多数细胞的细胞周期中存在G ₂期,此期DNA合成已经完成,但染色体尚未凝集与分离。从DNA合成结束过渡到有丝分裂,均能受到CDKS的精细调节,这与前面讨论的G ₁期到S期过渡非常相似。

M期,即有丝分裂期。M期一旦结束,就形成两个新的子细胞,一次细胞周期即告结束,细胞就进入下一个细胞周期的G ₁期。这期的生化特点是RNA合成停止,蛋白质合成减少及染色体的高度螺旋化。

活化的MPF可使细胞进入有丝分裂前期,当加入cyclin B时即被蛋白水解酶降解(因此关闭MPF的活性)。在有丝分裂期,染色体浓缩、分离和解聚。与染色体改变相协调,纺锤体两极复制(在S期)、分离、移动到核相对的两极参与染色体分离。有关染色体与纺锤体变化的分子基础了解甚少。最后,核膜崩解和重组装,纺锤体分解,细胞膜内陷完成胞质分裂。由于细胞自我复制的保真性,故在染色体分离之前每一DNA序列只能复制一次。这一严格的限制为一种称为许可因子(licensing factor)的活性物质所保证。它是DNA复制所必需,并且在S期DNA复制时被降解。在G ₂期的细胞核内缺乏有活性的许可因子,而且复制受限。但在有丝分裂期,核膜崩解时,胞质中的许可因子便进入核内。在细胞从G ₁期过渡到S期时,若随后存在其他能促进复制的活性因子,细胞就又可复制DNA。虽然许可因子的精确分子本质还不清楚,但是,近期研究结果提示它与极微染色体维持(minichromosomemaintenance,MCM)家族蛋白有关。总之,前面几节所讨论的所有这些活性物质,都参与调控细胞周期各阶段的协调运行,确保细胞DNA中的30亿碱基及时准确地复制一次,并把新复制的DNA平均分配到子细胞中。

细胞必须不断地把胞外信号传入胞内,参与调控细胞周期。细胞周期离不开胞外信号的作用,营养状况、细胞间接触和胞外多肽都能影响胞内事件。面临的一个重要问题是胞外因子如何与胞内机制相互作用以影响细胞周期进程。例如,生长因子可使静息细胞或G ₀期的细胞进入并完成周期。细胞从进入G ₁期一直到R点都离不开生长因子的持续作用。此后,细胞将通过余下的G ₁期阶段和S期。那么类似生长因子的胞外多肽是如何影响细胞周期的呢?

细胞因子,包括IL、IFN和CSF等,是细胞间通讯(cell-cell communication)的可溶性介质。细胞因子通常与细胞表面的特定受体结合,启动信号转导的级联反应,影响胞内事件,通常表现为多种基因的转录激活或抑制。有些细胞因子受体本身具有酪氨酸激酶的功能,而另一些细胞因子受体本身没有激酶功能,但能募集并活化非受体酪氨酸激酶,将信号向下游传导。

典型的细胞因子信号转导途径是表皮生长因子(EGF)与其受体的信号转导:首先,EGF与其受体的胞外区域结合,导致这个受体胞内区的一个酪氨酸残基自动磷酸化。接头蛋白Grb2和sos蛋白的复合物与该磷酸化区域结合,并通过将 ras基因结合的GDP置换成GTP导致原癌基因 ras活化。GTP结合型的 ras与丝氨酸/苏氨酸激酶c-Raf结合,并以某种方式活化c-Raf。然后Raf激酶使丝裂原蛋白激酶激酶(MAPKK)激活,后者又可使有丝分裂原蛋白激酶(MAPK,也称胞外信号相关激酶或ERK)磷酸化,并调节核转录因子如c-Fos/c-Jun和c-Myc的活性。这大致说明了胞外信号如何经过一系列生化反应调节基因表达。

细胞周期事件是高度有序进行的,晚期事件的起始依赖于早期事件的完成。例如,在真核生物中,有丝分裂的发生依赖于DNA合成的完成,S期DNA复制是为有丝分裂做准备。保证这一时序依赖的调控机制称为细胞周期检查点(checkpoint)。胞内、胞外许多不同事件可以引发细胞周期在这些检查点停滞。例如,营养匮乏、温度变化或其他应激、核苷酸耗竭及DNA损伤等都能通过激发对这些细胞周期检查点的调控,抑制细胞周期。

现在已经清楚,这些时序依赖性事件受细胞周期的某些特定基因产物调控,不单纯是阻遏信号的结构或其内在因素的问题。因此,这些调控检查点基因的突变会减弱阻遏信号,使细胞以异常方式持续进行细胞周期循环。这样的突变可能导致细胞对外界环境和引起DNA损伤的制剂作出异常反应,如提高或降低细胞死亡,提高突变率或遗传不稳定性。因此,细胞周期检查点基因的突变可能有利于癌症的发生,并影响肿瘤细胞对化学治疗和放射治疗的反应。

现在对由细胞周期检查点引起DNA损伤的研究最为深入。当细胞核DNA由内在或外在的因素损伤后,正常细胞会在细胞周期的某一检查点上停止运行。DNA受损的细胞通过以下方法避免DNA复制:停滞在G ₁期,或者是在细胞已经通过G ₁期的限制点后,通过抑制复制子的起始或延伸,暂时停滞在S期。另外,DNA受损的细胞能停滞在G ₂期避免细胞进入有丝分裂期。这些阻遏作用可能有利于防止细胞死亡,限制可遗传性基因突变,或者两者兼有。

抑癌基因 p53可能是信号转导途径的关键成分,可使DNA受损的细胞阻滞在G ₁期。DNA损伤使 p53含量增加,从而活化 P21 ^WAF/CIPI基因的转录,P21 ^WAF/CIPI的表达增强使cyclin E/CDK2活性受抑制,结果使pRb的磷酸化受阻,不能从G ₁期进入S期。在某些类型的细胞中,DNA损伤所诱导的p53似乎可以导致细胞程序化死亡,而不是停滞在G ₁期。 p53基因在人肿瘤细胞中突变率比较高,其正常功能的丧失可导致受损DNA的复制异常,或使正常情况下应凋亡的细胞存活下来。因此, p53突变为何有利于细胞恶变,以及 p53为什么在人肿瘤中频繁突变就很容易解释了。

在哺乳动物细胞中,DNA损伤导致S期受阻的分子调控还不很清楚。但是已发现大量控制S期检查点的酵母基因:如 mec1、 mec2和 hus1等。类似的基因在哺乳动物中还未发现,但是近期描述的 ATM(共济失调毛细血管扩张中的突变)基因,其DNA序列与 mec1基因有部分同源。有癌变倾向的共济失调毛细血管扩张患者的细胞,在全部3个辐射诱导检查点都有缺陷,包括S期检查点。近期研究结果提示,S期检查点装置可能与DNA复制装置本身相关。

DNA损伤诱导细胞停滞在G ₂期是大多数哺乳动物细胞突出的特点。由于G ₂期停滞与放射敏感性之间关系密切,所以多年来放射生物学家对此进行了深入研究。酵母中的 rad9、 rad17、 rad24、 mec1、 mec2、 mec3基因都参与DNA受损引起G ₂期停滞信号的传导,这些基因的突变导致细胞遗传不稳定性的增加和对放射敏感性的提高。哺乳动物细胞中调控这一检查点的基因还未发现,但是 ATM基因可参与上述检查点调控,G ₂期停滞发生在cyclin A上调之后和cyclin B上调之前。对涉及有丝分裂纺锤体或纺锤体极的检查点了解更少。有丝分裂中期异常的纺锤体能遏制细胞周期进程,纺锤体功能异常能导致非整倍体出现,纺锤体极错误会产生四倍体。上述两种染色体异常现象都存在于肿瘤细胞,所以调控途径的缺陷也有利于肿瘤发生。当微管装置被毒物破坏时,几种酵母基因( mad1、 mad2、 mad3、 bub1、 bub2、 bub3)可以参与有丝分裂的停滞,类似的基因在哺乳动物细胞中仍未发现。然而, p53参与小鼠细胞纺锤体检查点调节,可以解释培养的伴有 p53缺陷小鼠成纤维细胞中出现的非整倍体现象。

还有一种观点认为:细胞衰老也表现为细胞周期检查点受阻,它是以染色体端粒逐渐缩短为信号引发的。与端粒缩短有关的DNA链断裂可以正常启动一个或几个引起细胞周期停滞的信号。这个结果对肿瘤的发生非常重要,因为肿瘤细胞的检查点信号途径存在缺陷。因此,除端粒活性的重新表达外,某一重要生长抑制检查点信号丧失也可以提高肿瘤细胞的永生性。

癌细胞常有各种表型异常,包括失去分化、游动性或浸润性升高和药物敏感性降低。实际上,所有癌细胞的一个特征性表型异常是细胞周期调控失调。一种常见的错误看法是癌细胞自我复制的速度比正常细胞快。真正的原因是癌细胞缺乏对调控信号的正确应答,而这些信号在正常细胞中会导致细胞周期终止,并因此停止生长。正常细胞转化为肿瘤细胞有赖于控制正常细胞周期进程的基因突变,从而导致调节细胞生长信号的失控。参与细胞周期并增殖的细胞数量通过以下基因产物联合作用得以控制:驱动细胞通过细胞周期的基因产物(在简化模式中称为癌基因)和抑制细胞周期进程的基因产物(在简化模式中称为抑癌基因)。在简化模式中,组织中死亡的细胞数体现了基因产物的相对活性,这些基因产物包括阻断细胞程序化死亡基因(促凋亡基因)产物。因此,基因突变可导致以下多种因素共同作用,如:加速细胞周期的运行(如增强癌基因活性)、降低细胞周期的抑制(抑癌基因的丢失)、增加抗凋亡信号(如 bcl-2的过度表达)和降低促凋亡信号,使恶性细胞数量增加,从而发展为癌症。细胞分化也可能与减缓、终止细胞增殖相关,在恶性肿瘤中,一些驱动增殖的异常基因产物也抑制分化。

许多称为癌基因的基因实际上是正性生长信号,它们可分为以下几类:活性异常的生长因子(如c-Sis)、生长因子受体(如HER-2/neu和c-Fms)、胞内信号分子(如c-Src、Ras、c-Raf)和核转录因子,这些信号分子影响细胞周期的机制前面已有讨论。在这些基因中,激活的突变导致信号增强,从而使细胞周期异常。

一些控制细胞周期的基因产物也影响凋亡的发展(如c-Myc、P53、pRb)。研究表明,相互拮抗的细胞周期信号在细胞中同时起作用,或者细胞生存所需要的细胞外的多肽信号被阻断,都会使细胞发生凋亡。一些模型也把凋亡理解为细胞周期不可或缺的部分,正如G ₀期到G ₁期的过渡为进入细胞周期的开始一样,凋亡性死亡被看作是细胞从细胞周期中永久地退出。研究还提示,如果细胞通过周期时没有存活所需的因子(激素或生长因子)以保持其存活,细胞凋亡就是细胞周期的自然结局。因为对当前抗肿瘤治疗手段(化学治疗和放射治疗)的疗效也可能受细胞凋亡倾向性的影响,所以,细胞凋亡对治疗有明显的预示作用。另外,凋亡信号的丧失可能是肿瘤发生中重要的突变事件。