第三节　细胞治疗药物

19世纪末，外科医生William Coley报道将灭活的细菌注入肉瘤中可导致肿瘤缩小，从此免疫学与肿瘤学这两个领域有了联系。此后，人们对免疫监视与肿瘤的发生发展相互关系的认识快速发展，使得肿瘤的治疗取得了很大进步，目前在所有类型的肿瘤中均有研究。

根据原理，免疫治疗可以分为主动免疫治疗和被动免疫治疗。目前主动免疫治疗在研的有黑色素瘤的免疫接种和以树突状细胞为基础的疫苗。被动免疫治疗的模式是从对血液系统恶性肿瘤和黑色素瘤的细胞治疗发展而来。一般来说，发生转移的黑色素瘤对化疗和放疗普遍不敏感，但一些患者的肿瘤却能自发消退，提示黑色素瘤具有免疫原性，这一点不同于其他肿瘤。研究人员在人类黑色素瘤中最先发现了能够被T细胞所识别的肿瘤特异性抗原。随后，大量的肿瘤相关抗原相继被识别和鉴定，打开了靶向这些候选肿瘤抗原实现选择性杀伤肿瘤细胞的免疫治疗大门。其中细胞过继免疫治疗属于被动免疫治疗，主要是把自己或同种异体肿瘤未经过特异性改造的免疫细胞，或针对特定抗原进行改造的免疫细胞输注给患者以达到肿瘤消退的目的。这种方法已经在移植相关肿瘤如白血病和黑色素瘤的治疗中获得成功。黑色素瘤的细胞过继免疫治疗过程是：先在体外筛选与肿瘤抗原亲和力高的淋巴细胞，再经过体外扩增，最后和大剂量白介素-2（IL-2）一起输注给患者。这些过继细胞能够在患者体内扩增，并迁移至肿瘤部位引起肿瘤消退，所达到的临床效果客观而持久。

CD8 T细胞是适应性免疫的一种关键效应细胞，主要功能是清除机体中被胞内病原体（如病毒）侵袭损害的体细胞，但恶性转化的体细胞（即癌细胞）也能够表达可以被该群T细胞识别的抗原表位，因而其特异性免疫应答在控制肿瘤发生发展过程中具有重要作用。通常这种T细胞治疗涉及三个环节：①从体液（如血液）或组织（如肿瘤病灶）中获取T细胞；②富集抗原特异性T细胞并规模化培养扩增；③输注给患者构建免疫保护机制。根据抗原特异性T细胞的不同富集方式，T细胞治疗已经发展形成了2个分支，即“天然”T细胞治疗和“工程”T细胞治疗。前者是指从体内直接获取具有抗原特异性T细胞受体（T cell receptor，TCR）的T细胞又称内源性T细胞，可用于控制病毒感染及恶性肿瘤；后者是采用基因工程技术使得T细胞表达抗原特异性的识别受体，主要研究焦点是控制恶性肿瘤。

在机体中抗原特异性的T细胞具有两个重要特征，一是表达表位特异性的TCR；二是经嵌入相应肽段表位的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）复合物（peptide-MHC，pMHC）刺激TCR后能够分泌细胞因子（如IFN等）并表达多种激活标志（如CD137等）。根据这些标志即能够富集到所需的抗原特异性T细胞。迄今为止，“天然”T细胞治疗在控制病毒感染和治疗多种类型肿瘤中均显示了确切疗效。其中包括病毒抗原特异性的T细胞治疗，以及肿瘤抗原特异性的T细胞治疗，但是临床上制约“天然”T细胞制备的主要因素有两个，一是靶标抗原特异性T细胞的含量甚微（如在外周血中，单一表位特异性T细胞仅占CD8 T细胞总数的1/105），富集此类T细胞的技术难度很大；二是特异性T细胞亚群对相应抗原的亲和力存在明显差异，其中低亲和力的T细胞亚群不足以激发高效免疫保护功能。

随着基因工程技术与细胞免疫技术的交叉融合，“工程”T细胞被赋予了诸多独特的生物学特性，克服了上述提到的“天然”T细胞治疗的障碍，是该项技术的主流方向。“工程”T细胞治疗常见的有：嵌合抗原受体T细胞免疫疗法、T细胞受体工程化T细胞疗法、自然杀伤细胞疗法、树突状细胞疗法等，本节对上述几种细胞治疗技术进行介绍。

一、嵌合抗原受体T细胞疗法

1989年Gross等提出嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）疗法，之后经过不断改良直到2013年应用到临床成功治愈晚期急性淋巴细胞白血病。CAR-T疗法综合了细胞治疗、基因治疗和免疫治疗，基本原理是利用患者自身的免疫细胞来清除癌细胞，具体做法是将抗原抗体的高亲和性与T细胞的杀伤作用相结合，通过构建特异性嵌合抗原受体，经基因转导使T细胞表达特异性嵌合抗原受体，特异性识别靶抗原从而杀伤靶细胞。CAR-T疗法与传统肿瘤治疗方法相比，其优点包括以下几个方面：①精准治疗，其独特的作用机制既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大肿瘤抗原靶点范围，其不依赖主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）递呈抗原，因而可以克服肿瘤细胞通过下调MHC降低抗原递呈而介导的免疫逃逸，能追踪肿瘤细胞，产生杀伤作用且避免对机体正常细胞造成损伤。②CAR-T疗法抗肿瘤应用范围广泛，因其不依赖于不同个体的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），理论上只要能够表达相同的肿瘤抗原，即可适用同一种靶向分子CAR-T，所以针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，就可以用于表达相同肿瘤抗原的肿瘤细胞，意味着应用范围可以更广。③CAR-T通过基因改造可实现持久抗肿瘤效果，将促进T细胞增殖与活化的基因序列加入新一代CAR结构中，将促进T细胞的体内增殖，同时使其具有免疫记忆功能，能够长期在体内存活生效。然而不可否认的是，CAR-T疗法作为一种新兴的治疗手段，其用于临床的安全性不容忽视，其治疗过程中也存在着潜在的毒副作用，如较为常见的发热、皮疹、寒战、低血压等，严重时可引起细胞因子释放综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性等。

（一）CAR-T作用机制

T细胞是人体内特异性抗肿瘤的效应细胞，并具有MHC限制性。肿瘤细胞表面MHC表达下调，导致免疫逃逸发生，CAR-T与特异性肿瘤抗原结合后，可引起MHC非限制性活化，其发挥的抗肿瘤效应不受免疫逃逸的影响。CAR-T可产生穿孔素、颗粒酶等直接介导肿瘤细胞溶解，同时分泌干扰素γ、白细胞介素-6等细胞因子，间接影响肿瘤细胞的生长。另外研究发现CAR-T可促进局部细胞的增殖，外周血单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞，上调表达干扰素γ等细胞因子，改变肿瘤微环境的免疫状态，使肿瘤微环境从免疫抑制变为免疫激活，从而对肿瘤生长产生不利影响。综上，CAR-T疗法抗肿瘤的作用原理主要为：①通过MHC下调抵抗免疫逃逸；②产生白细胞介素-6、白细胞介素-10等细胞因子，间接影响肿瘤细胞的生长；③改变肿瘤微环境状态，抑制肿瘤的生长。

（二）CAR-T结构

CAR-T由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区三部分构成（图1-1）。胞外抗原结合区由单链抗体（single chain fragment variable，scFv）与铰链区（spacer）连接形成。单链抗体由轻链可变区（VL）、重链可变区（VH）以及它们之间的15个氨基酸［（Gly4，Ser）3 linker］链接肽组成，铰链区通常来源于CD8或者IgG。胞外抗原结合区对特定肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）有特异识别功能，其与TAA间的亲和力决定了CAR-T与靶细胞的结合能力。跨膜区（transmembrane domain，TD）通常由同源或异源二聚体膜蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD28组成，主要起着连接抗原结合区与胞内信号区进行信号转导的作用。胞内信号转导区主要由T细胞受体TCR/CD3ζ链、免疫球蛋白Fc受体的γ链或CD3ε链构成，通常包含免疫受体酪氨酸激活模体（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），负责信号转导。共刺激区起着调节和增强CAR-T功能的作用。共刺激区通常由细胞表面共刺激分子的信号转导域组成，这些共刺激分子通过与抗原递呈细胞上的共刺激分子结合，提供额外的信号刺激，以增强T细胞的活化、增殖和生存能力。共刺激区的存在可以帮助CAR-T克服T细胞抗原识别的耗竭现象，增强CAR-T的持久性和效能。T细胞活化区的主要功能是传递活化信号，促使CAR-T激活并展开免疫应答。T细胞活化区通常由CD3ζ域组成，CD3ζ域可以与其他信号分子相互作用，从而引发下游信号级联反应，促进T细胞的活化和效应功能。

（三）CAR-T发展历程

经过多年的发展，CAR目前分为四代（结构如图1-2所示），主要区别在于共刺激信号不同：第一代CAR胞内信号转导区只包含单一的TCR/CD3ζ链或Fc受体的γ链或CD3ε链结构域，在体外实验中可以识别靶抗原并有效杀伤肿瘤细胞，同时分泌INF-γ，但是在临床试验中表现出体内存活时间短，回输3周后，外周血中无法检测到第一代CAR-T。第二代CAR胞内信号转导区除了TCR/CD3ζ链结构域外，串联了一个共刺激结构域（costimulatory domain，CSD），例如 CD27、CD28、CD134（OX40）或 CD137（4-1BB）等。加入共刺激结构域后，第二代CAR-T可以分泌更多的IL-2，细胞凋亡信号通路处于抑制状态，抗原刺激后CAR-T大量扩增，弥补了第一代CAR-T随着时间延长数量减少的缺陷。其中，加入CD28共刺激结构域，除了增强细胞持续活化外，还有效解除了调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）对CAR-T的抑制作用，使第二代CAR-T在肿瘤微环境中能够更好地发挥杀伤功能。第三代CAR是在TCR/CD3ζ链结构域的基础上，同时串联了两个共刺激结构域，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，增强杀伤肿瘤细胞作用。体外分析二代与三代CAR-T的功能并无明显区别，但在针对不同肿瘤类型的小鼠模型中，它们表现出不同的治疗活性。第四代CAR-T TRUCKs（T cells redirected for universal cytokine-mediated killing）除了嵌合抗原受体基因外，还整合表达免疫因子、共刺激因子配体，如促炎性细胞因子白细胞介素-12（IL-12）等，成功激活CAR的信号通路。这种被改造后的T细胞可以在CAR识别靶抗原后，通过激活下游转录因子活化T细胞的核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）来诱导表达IL-12，从而招募环境中的其他免疫细胞（树突状细胞、吞噬细胞和自然杀伤细胞等），参与对不表达靶抗原的肿瘤细胞的清除。同时，被募集在肿瘤附近的免疫细胞还可以通过分泌某些细胞因子（如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、IL-4和IL-5等）来调节肿瘤附近的微环境，解除其免疫抑制性，通过调动机体自身免疫力参与对肿瘤细胞的杀伤作用。

（四）临床应用

CAR-T疗法在血液系统肿瘤中治疗效果较好，其中靶向CD19的CAR-T疗法在治疗儿童和成人复发B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤方面表现出稳定高效的抗肿瘤效果。在各种临床研究中，虽然CAR的设计有所不同，但靶向CD19的CAR-T疗法仍是复发/难治B细胞恶性肿瘤的一种非常有效的治疗方法。目前，世界上首个靶向CD19的基因修饰自体T细胞免疫治疗药物（tisagenlecleucel）于2017年被美国FDA批准上市，主要针对25岁以下复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗。在美国，该药只能通过药品风险评估和减轻策略获得，美国FDA药品说明书列出了细胞因子释放综合征和神经系统事件的黑框警示。配发这些药物的机构需要特殊认证，员工必须经过培训能够识别和管理不良事件，并且必须随时备好托珠单抗。

（五）技术困境及局限性

目前，CAR-T疗法在治疗淋巴造血系统恶性肿瘤上已有较好的成效。但在实体肿瘤治疗中尚未达到理想的效果，还没有实质性的突破，其中较重要的原因在于，与血液系统肿瘤相比，实体肿瘤细胞更容易与外周非肿瘤细胞基质形成肿瘤微环境，该环境能够抑制免疫的发生，以保证自身的增长，而这对于肿瘤的杀伤和长期预后有很重要的影响。如今对实体肿瘤微环境改善手段尚未成熟，限制了其发展。另外，实体瘤中存在多种抗原，无法通过此种治疗方法达到很好的靶向性也是一方面原因。目前在部分实体瘤治疗上有进行临床试验的CAR-T疗法有晚期结直肠癌和恶性胶质瘤，疗效均有待提高。

另外，CAR-T疗法在治疗过程中出现的不良反应对患者生命有极大的威胁，因此了解该疗法中不良反应出现的原因及应对措施对该疗法治疗肿瘤的发展和推广有着极其重要的意义。从大量临床试验的结果中可以看出，CAR-T自身结构的不足、不同患者在治疗期间CAR-T剂量的差异以及其他因素均易引起各种不良反应的发生。常见的非血液学不良反应有：细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）、CAR-T治疗相关脑病综合征（CAR-T related encephalopathy syndrome，CRES）。血液学不良反应有：噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）、弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）、B细胞发育不良、造血功能恢复延迟等，严重者会导致死亡。

CRS是CAR-T毒性反应的一种，是CAR-T输注到体内，其受体与肿瘤细胞表面抗原结合后，CAR-T激活并增殖，杀伤肿瘤细胞，同时激活单核巨噬细胞系统，细胞因子级联释放，导致发热，多脏器、多系统功能受损为临床表现的综合征。可发生在接受CAR-T治疗的90%以上患者，通常在CAR-T输注后2～3天开始，7～10天达高峰，大多数患者最早出现的症状都是发热，随后可能会有心动过速、呼吸急促、低血压、低氧血症、多脏器功能衰竭等。经过积极治疗，大多数的CRS都可以得到纠正，但仍有部分患者发生了致命的不良反应。所以，对于高风险发生严重CRS者预防更重要，目前也提出一些理论与方法，但是需要进一步验证以及相关的临床研究证实。

CRES发生率约为20%～64%，可以在CRS期间发生，也可以在CRS消退后发生，或者有少数患者没有CRS表现，神经毒性单独发生。常见临床表现有头痛、焦虑、谵妄、失语、定向障碍、震颤，较重者还可能有癫痫发作、意识水平下降、全身麻痹、颅内压增高、脑水肿。影像学检查CT/MRI通常无明显异常，若检查发现血管性水肿、软脑膜增强、多灶性微出血等异常则提示预后不良，CRES严重程度变化迅速，严重的脑水肿患者甚至可能在24小时内出现脑死亡，因而对于CRES需要及早做出诊断、评估及治疗。

二、T细胞受体工程化T细胞疗法

T细胞通过T细胞受体（T cell receptor，TCR）特异性识别靶细胞表面的相应pMHC从而发挥免疫效应。然而，从体液或组织中富集此类T细胞培养扩增存在若干限制因素，一是不易获得高亲和性TCR-T；二是经体外培养扩增的T细胞输注后难以在受者体内长期生存。克服这些障碍一个直观的解决方式是将TCR编码基因克隆后进行基因工程改造使之具有高亲和性，然后高效导入T细胞避免较长时间的扩增培养。这种TCR工程T细胞显然与“天然”T细胞一样，具备特异性靶向所有细胞蛋白抗原的潜能，其优点是此类TCR与相应抗原的亲和力较高并且在T细胞表面的表达密度也高，因而疗效更明显。

（一）基本原理

TCR是T细胞受体工程化T细胞（T cell receptor-engineered T cell，TCR-T）疗法的基础，是T细胞表面特异性识别抗原并介导免疫应答的异二聚体。TCR分子的特殊结构决定了T细胞的抗原特异性，由4种多肽链α、β、γ、δ组成了TCRαβ和TCRγδ两种TCR；TCRαβ大多存在于人外周血中，而TCRγδ主要分布在皮肤和黏膜组织，TCR上每条肽链可分为可变区（V区）、恒定区（C区）、跨膜区和胞质区。TCR-T疗法首先从肿瘤患者体内鉴定出含有肿瘤抗原特异性的TCR，在体外经T细胞扩增、克隆和分选提取出目标TCR基因序列；将TCR基因序列与载体结合并侵染宿主体内T细胞，得到TCR基因工程改造的T细胞对肿瘤细胞起到特异性免疫效果，最终达到杀灭肿瘤细胞治疗癌症的目的。而其中的重要环节是TCR-T疗法的转导技术。自TCR-T疗法问世以来，研究者们不断对TCR-T各个环节进行调节和完善。对于TCR转导过程，逆转录病毒载体转导和不需要病毒载体的CRISPR/Cas9基因组靶向系统都是可行的。Lee等认为，逆转录病毒载体转导TCR可以快速产生和筛选多个TCR，是一种成熟、安全、有效的TCR转导方法。Eyquem等指出，CRISPR/Cas9基因组编辑可能会推进免疫疗法的进程，延迟效应T细胞的分化和衰竭；良好的基因编辑技术促进了TCR-T的表达，增强了TCR-T技术的安全性，CRISPR编辑的CAR-T和TCR-T为实体瘤的治疗带来希望。Roth等认为，设立不需要病毒载体的CRISPR/Cas9基因组靶向系统相比于逆转录病毒载体的转导方式，在人类原代T细胞基因组中快速向特定位点插入DNA更加高效且操作灵活。逆转录病毒载体和CRISPR/Cas9基因组编辑在不同TCR-T疗法研究中的最佳选择和应用，TCR转导方式的不同是否会影响TCR-T疗法的结果，以及如何更好利用这两种方法对TCR-T疗法进一步完善十分关键。

（二）临床应用

世界上第一个TCR基因治疗的临床试验于2006年被报道。在Ⅰ期临床试验中，研究人员用逆转录病毒载体转到患者自体外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte，PBL），改造后的PBL所表达的TCR具有抗MART-1功能，用于治疗HLA-A2阳性的转移性黑色素瘤患者。首先，从切除的黑色素瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）克隆TCR，克隆的TCR能识别MART-1抗原的27～35表位。经Vβ12蛋白染色方法鉴定，其基因转导效率为21%～72%，在CD4+和CD8+细胞中该基因的转导效率基本相同。在过继输入细胞后1年内都能检测到基因修饰的T细胞。输入T细胞后，17名患者中有2名发生肿瘤消退。除了最初的报道外，共有31名患者接受了该项治疗，其中4名（13%）转移黑色素瘤患者出现瘤体消退。尽管首次人TCR转到临床试验的反应率低于TIL实验报道的反应率（50%～70%），但该试验还是为TCR改造T细胞的新型基因免疫疗法提供了第一手资料。

目前，TCR-T疗法主要靶向HLA-A*02:01等位点递呈的抗原表位，如MART-1、gp100和MAGE-A3/4等，选择治疗的肿瘤包括黑色素瘤、滑膜肉瘤、多发性骨髓瘤、食管癌和结直肠癌。但临床研究发现，此类抗原表位的肿瘤特异性不足，输注TCR-T后会出现令人意外的严重毒副反应。其中具有显效低毒特性的一个案例是靶向NY-ESO-1。纽约-食管鳞状细胞癌-1（New York esophageal squamous cell carcinoma-1，NY-ESO-1）抗原由位于染色体Xq28区的CTAG1B基因编码，其转录的mRNA约747bp，表达的蛋白质含180个氨基酸。NY-ESO-1抗原在各种正常组织中几乎不表达，因而作为肿瘤抗原的特异性很好。在恶性肿瘤中，NY-ESO-1抗原表达频率较高的有神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、黑色素瘤、卵巢癌和骨髓瘤等。

TCR-T疗法的主要制约因素是人群中HLA等位基因表达复杂，靶向单个HLA位点（如HLAA*02:01）、单个抗原表位的TCR-T仅适用于少部分患者，实施此类T细胞治疗的大样本临床研究难度很大。此外，高效TCR编码基因通常要从治疗显效的TIL细胞中筛查，而制备此类T细胞需要前期的大量研究积累，目前尚缺少此类相关实验数据。

（三）挑战

另外，实体肿瘤TCR-T疗法还面临着众多的挑战：①靶标毒性，是指TCR-T攻击肿瘤细胞的同时也攻击表达TCR-T靶向抗原的正常细胞，使得健康组织受损。②脱靶毒性，是指TCR-T无法区分肿瘤细胞表面特异性抗原和正常细胞抗原，损伤了表达与靶点相似抗原表位的健康组织。③肿瘤抑制性微环境，包括T细胞浸润抑制、低氧抑制、抑制性分子表达增多等。④肿瘤异质性，指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。造成恶性肿瘤异质性的原因主要包括癌细胞基因突变、表观遗传学改变、基因拷贝数变异等遗传水平的变异，可能会限制TCR-T的功能表达。

三、自然杀伤细胞疗法

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是独立于T细胞、B细胞的第三类淋巴细胞亚群，属于固有免疫细胞，是机体防御的第一道防线，不仅具有抗感染、免疫调节和抗肿瘤等多重作用，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞主要来源于骨髓淋巴样干细胞，约占体内淋巴细胞的10%，主要分布于外周血和外周淋巴组织。

（一）作用机制

NK细胞抗肿瘤作用依赖其细胞毒性，NK细胞杀伤肿瘤细胞机制包括：①穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒性作用；②死亡受体介导的靶细胞凋亡；③分泌细胞因子促进杀伤活性；④ADCC。

NK细胞杀伤的靶细胞主要包括肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体（如真菌和寄生虫）、同种异体移植的器官与组织等。通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）及共刺激受体依赖、MHC非依赖方式识别病变细胞，不需提前免疫致敏，可在几十分钟内杀伤恶性细胞，因而被认为是最有效的体内监视和清除病变细胞的免疫细胞亚群，故在机体抗肿瘤、早期抗病毒或胞内细菌感染的免疫应答中有重要作用。近几年，随着肿瘤分子机制的深入研究，NK细胞的抗肿瘤作用备受关注，已形成多种不同的研究方法，包括NK细胞被动免疫治疗、免疫检查点抑制剂、基因修饰NK细胞表达嵌合抗原受体等。

NK细胞被动免疫治疗包括同种异体和自体NK的被动治疗，适用于免疫力低下的患者，尤其是放疗、化疗后、骨髓移植等患者。自体NK细胞KIR和MHC-Ⅰ配体结合能抑制NK细胞的活化，而同种异体NK细胞KIR和MHC-Ⅰ配体不匹配，故打破了这种限制，有效活化NK细胞，启动抗肿瘤反应。过继的NK细胞与树突状细胞相互作用，产生的INF-γ能有效刺激Th1辅助细胞，从而进一步增强T细胞抗肿瘤免疫反应。同时，肿瘤致敏的NK细胞分泌IFN-γ能增加肿瘤细胞MHC-Ⅰ分子的表达，从而促进CTL细胞的特异性识别和杀伤肿瘤细胞。Lundgren发现NK细胞浓度与肿瘤预后和患者总生存率呈正相关，证实NK细胞被动免疫治疗在抗肿瘤方面的潜能。

（二）临床应用与局限

目前，使用自体NK细胞来治疗肿瘤，使部分患者得到缓解，血液免疫性指标有所提升，部分肿瘤进展得到限制，预后良好，生活质量也获得提高。总体来说，自体NK细胞输注对部分患者的肿瘤治疗有一定的治疗效果，但是临床也有部分患者效果不明显，可能有以下原因影响疗效：①部分肿瘤细胞表面表达MHC，造成该肿瘤细胞发生逃逸，无法发挥NK细胞的杀伤作用。②部分肿瘤患者体内的免疫功能本身存在缺陷，导致自体培养扩增的NK细胞功能不强，不能达到杀伤肿瘤的效果。鉴于肿瘤患者自身的NK细胞存在扩增的难度，扩增成功也可能存在细胞毒性及功能不强的缺点，因此许多学者试图通过异体NK细胞应用于肿瘤的免疫治疗。异体细胞来源主要是同源异体的健康人群细胞、建立符合临床治疗要求的细胞系等。目前，异体NK细胞主要是使用半相合的供者，有研究认为健康供者的细胞所培养出的NK细胞在功能上更强，疗效更好。但是异体NK细胞的使用也还存在很多未知的问题，如异体NK细胞回输患者体内后的生存期，对患者自身的免疫系统影响，异体输注的安全性、不良反应等，还需要进一步的临床研究。

四、树突状细胞疗法

树突状细胞（dendritic cell，DC）起源于造血干细胞，是目前发现的一类功能最强大的并可以激活未致敏初始型T细胞抗原提呈细胞，因此DC也被称为免疫系统的“哨兵”。1973年美国学者Steinman和Cohn等从小鼠脾组织中分离发现，因其形状具有树突样或伪足样突起而命名。它是机体内的一种抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC），能捕获、摄取抗原，并加工处理后呈递给T细胞，能够激活机体内的多种效应细胞，是已知的肿瘤抗原提呈能力最强的细胞。参与介导抗肿瘤免疫，因此它们已经成为大多数抗肿瘤细胞免疫治疗研究中的首选APC，尤其是抗肿瘤应答依赖于传统的树突状细胞（conventional dendritic cell，cDC）的特异性亚型。尽管存在多种其他专职性抗原提呈细胞，包括其他DC亚型，但是cDC特别适合引发T细胞应答，指导T细胞极化，以及在MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ上呈递外源性和内源性抗原。

DC广泛地存在于淋巴组织和非淋巴组织中，在血细胞中仅占单核细胞总数的0.5%～1%。人体内绝大多数DC是以不成熟的状态存在的，表达低水平的共刺激分子和黏附分子，但具有极强的抗原内吞和加工处理能力。不成熟的DC在摄取抗原或受到某些炎性介质刺激后开始逐渐分化成熟，从外周组织（如脾脏、心脏、皮肤、胃肠道等）通过淋巴管引流迁移至次级淋巴器官成为成熟的DC。成熟DC摄取和加工抗原的能力较弱，但其特征性的高表达主要组织相容性复合体Ⅰ类、Ⅱ类分子，CD80、CD86等共刺激分子以及CD40、CD44等黏附因子等，因而在淋巴器官中的T细胞区域，DC可以有效地将抗原呈递给抗原特异性T细胞，充分地激活静息的T细胞，启动T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应。另外，DC自身也可以合成分泌一些细胞因子，如IL-12，从而诱导T细胞、自然杀伤细胞产生大量的肿瘤坏死因子、穿孔素和颗粒酶，使肿瘤细胞溶解，起到直接抗肿瘤的作用。由此可见，DC在机体抗肿瘤的免疫反应中起到了非常重要的作用。DC与恶性肿瘤的发生、发展有着密切的关系。大多数肿瘤患者体内DC数量减少或功能缺陷，表达的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子及共刺激分子较低，而且肿瘤细胞自身的抗原活性较弱，机体内的DC不能对肿瘤细胞抗原进行有效识别和摄取。一般情况下，DC数量浸润较多的肿瘤分化程度高，预后好，而DC浸润数量少的肿瘤常有分化程度低和恶性进展迅速的特点。研究表明肝癌微环境中DC数量与肝癌患者预后的关系，结果显示DC的浸润数量可预测肝癌的转移与复发。在肿瘤微环境中给予足量的DC浸润时，由于肿瘤细胞造成DC过早凋亡或功能缺陷，无法呈递抗原激活T细胞，仍然不会对肿瘤细胞起到有效杀伤作用。可见，应用足够数量和功能正常的DC进行免疫治疗是非常重要的。

由前体细胞产生DC制造了足够数量的抗原提呈细胞的方法，快速用于临床，从而产生了首个基于DC的疫苗接种研究。一般来说，这种形式的免疫治疗需要离体产生的DC负载肿瘤抗原，随后重新回输患者体内，以刺激由CD8+和CD4+T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。首次报道的关于DC的临床研究于1996年出版，且以DC为基础的肿瘤免疫治疗相关的实验与临床研究在国内外不断开展，尤其是将DC与其他治疗手段相结合，这显示出肿瘤免疫治疗的强大优势，免疫治疗在当今时代已成为潮流。

（一）作用机制

1.DC的直接作用

DC作为最有效的抗原提呈细胞，直接回输患者体内进行免疫治疗，从理论上讲是一种最简单、直接的方法。肿瘤患者本身DC受抑制，成熟度低，通过体外技术的处理，改变DC的成熟状态便是一种可行的方法。由于DC是一种高度分化细胞，增殖能力较差，体外培养主要由外周血单个核细胞诱导分化而来，因此对血源有要求。其中对于健康和基本状态良好的患者，自体外周血是DC来源的主要途径。然而人体外周血单个核细胞中DC仅占有0.1%～0.5%，为了获取治疗量的DC数目，往往要求一次性提取患者大量血液，部分患者难以耐受，如老年患者、有血液病的患者。有研究人员试图通过脐带血培养DC的替代方式达到DC治疗的目的。虽然体外培养、扩增DC的方法尚无统一标准，但实际上大多数研究使用的方法均大相径庭，均通过特定的细胞因子诱导单个核细胞获取DC。使用抗原刺激成熟，细胞因子可刺激DC成熟。其中，TNF-α是目前常用的促进DC成熟的细胞因子。通过体外对DC的培养和抗原负载再促进其成熟，有效避开了肿瘤患者体内对DC潜在的抑制环境，这种人为处理后的DC疫苗能诱导机体产生特异性效应T细胞并杀伤肿瘤细胞，且激活免疫记忆系统对控制肿瘤复发起到良好效果。体外培养和扩增DC已能在技术上实现，目前焦点在于如何更好地负载肿瘤抗原。

2.肿瘤抗原负载DC

利用肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原融合DC是目前研究最多的肿瘤免疫方法之一。目前大多数抗原肽来源于肿瘤相关抗原，包括人端粒酶反转录酶、黑色素瘤抗原、癌胚抗原等。其原理为通过特定的抗原表位与DC的特定主要组织相容性复合体分子结合，从而激发机体的肿瘤免疫反应。一项Ⅱ期临床试验将G17DT疫苗用于晚期胃癌患者的治疗，结果发现61%的患者表现出免疫应答，且肿瘤的进展时间及中位生存时间均长于对照组。这类特异性抗原之所以受到众多研究的追捧，关键在于能够激发特异性抗肿瘤反应，达到靶向治疗的目的。另外，合成抗原能负载的DC治疗，避免了自体肿瘤抗原受手术的限制。特异性肿瘤抗原能够提高DC疫苗治疗的特异性及避免可能的自体免疫反应，但特异肿瘤抗原的发现、鉴定与提取是一项庞大的工作，需耗费大量的时间成本来进行。而且有些癌种如胃癌，尚未发现有效的特异性抗原。因此，给予肿瘤全细胞抗原（肿瘤细胞裂解物、凋亡的肿瘤细胞等）致敏DC成为最直接、简便的一种方法。常用超声波破碎、反复冻融、诱导细胞凋亡等方法制备肿瘤裂解物和凋亡细胞作为抗原，也可通过聚乙二醇或电融合技术将DC与肿瘤细胞融合。这种抗原具有多种抗原表位，能够激发T细胞免疫反应，更有利于诱导DC对肿瘤抗原的递呈，减小肿瘤逃逸的概率。肿瘤全细胞抗原致敏DC不仅不需要分离鉴定肿瘤抗原，还可提供多种抗原表位供DC识别、诱导广泛的T细胞应答，并且制作疫苗相对简单方便，可广泛适用于多种肿瘤，避免发生某些变异株或缺陷株的免疫逃逸和继发转移，保证抗肿瘤免疫的全面性和强效性。但由于非肿瘤相关抗原量大且种类多，DC在呈递过程中将肿瘤细胞中的一些自身抗原传递，非常容易诱发自身免疫性疾病，而且还存在融合培养的制备过程过于烦琐、难以纯化、最佳刺激量不确定等问题。另外，在临床实际操作中，提供大量的瘤体组织和细胞较为困难。

3.DC联合杀伤细胞免疫治疗

人体免疫系统的中枢性耐药机制及肿瘤微环境内部特殊的免疫抑制状态，使得单独应用肿瘤DC疫苗的疗效，可能不如预期的理想，而联合免疫治疗可能是最有效的方法。这不仅仅是传统的放疗、化疗与DC疫苗间的联合应用，还包括多种肿瘤抗原的联合应用以及不同种类免疫治疗方法的联合应用，如免疫检查点抑制剂和DC联合应用是一个研究的热点。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cell，CIK cell）通过抗CD3单克隆抗体、IFN-γ和IL-2诱导外周血淋巴细胞得到的一类CD3+和CD56+的细胞具有细胞毒性和分泌细胞因子来杀伤肿瘤细胞。将DC与CIK细胞共同培养，可以增加抗肿瘤协同作用。

（二）前景

DC在恶性肿瘤的发生、发展中具有十分重要的作用。在基础实验与临床应用中，以DC的直接作用、肿瘤抗原负载DC、DC联合杀伤细胞免疫治疗等方法，在肿瘤免疫治疗中取得了良好的效果与广泛的应用。以DC为基础的免疫疗法已经成为当今肿瘤治疗中有前途、有价值的方法之一。当然，在实际运用中仍然存在一些问题，如DC诱导的最佳途径，肿瘤抗原的种类与负载手段，回输的剂量、次数及注入途径等。随着生物技术的不断发展，人们对DC的认识也会更加深入、全面，从而研究出更为成熟的技术，将DC广泛地应用于临床，充分发挥DC抗肿瘤的重要作用。

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