第二节　纤维SPME理论

纤维SPME技术可用于测定气体、液体、固体样品中的目标化合物，操作中涉及纤维的涂层，样品的基体以及样品的顶空气相，是一个复杂的多相平衡过程。萃取开始时分析物吸附在涂层与样品基体的交界面上，然后再大量扩散到涂层中。如果分析物在固定相中的扩散系数很高，萃取就以吸收的方式进行，分析物可以在两相之间完全分开。如果扩散系数较低，分析物将以吸附的方式附着在涂层表面。

一、纤维SPME的基本原理与数学模型

如果使用液态聚合物涂层，当单组分单相体系达到平衡时，涂层上富集的待测物的量与样品中待测物浓度线性相关［12］。在理想的情况下：①化合物只通过扩散方式从液体样品向固定相迁移；②化合物从溶液向固定相的迁移无需其他能量；③化合物在样品中的浓度对纤维固定相的物理性质没有影响。可以得到以下数学公式：

n=KfsVfc0Vs/（KfsVf+Vs）　　（3-1）

式中，n为萃取涂层上吸附的待测物数量；Vf、Vs分别为涂层和样品的体积；Kfs是待测物在涂层与样品间的分配系数；c0为待测物的初始浓度。

根据这一理论模型，在混合均匀的样品中，就只考虑化合物向固定相的扩散，而无须考虑化合物在溶液中的扩散过程。萃取量不仅与化合物在固定相中的扩散系数成比例，还与固定相的体积成比例。而对于不能很好混合的液体样品，化合物在液相中的扩散必须加以考虑。实验证明，混合均一的溶液实际上很难得到，因为化合物在纤维周围的扩散要通过一个稳定的薄液层，因此实际的操作时间往往要比预期的还要长。

若萃取涂层对有机化合物的亲和力较强，那么待测物的Kfs值就很大，也就是说SPME能有效富集化合物并具有较高的灵敏度。当Kfs足够大（KfsVf≫Vs）时，纤维的萃取量为：n=c0Vs，可达到完全萃取。但在多数情况下，Kfs值较小，不能达到完全萃取，但经过适当的校正，还可用于定量分析。当样品体积Vs≫KfsVf时，式（3-1）可简化为：

n=KfsVfc0　　（3-2）

此时涂层上分析物的吸附量直接与基体中分析物的浓度成比例，而与样品的体积无关，这为SPME的野外采样提供了依据，即可用萃取头直接在环境中采集样品，所以没必要在分析前选择限定的样品。将纤维暴露在大气中或浸入湖泊、河流中，萃取结束后再把纤维带回实验室进行分离测定。为避免途中的样品损失，可用橡胶塞堵住萃取头的针头，或将萃取头冷冻起来。如此简化采样步骤，整个分析过程可以大大加快，也可以防止样品的分解和一般采样容器内壁对分析物的吸附所引起的误差。

另外，由于纤维固定相的体积相对较小（小于0.66μL），一次萃取操作的提取水平很低，如对于血样中的有机磷农药萃取量仅为总量的0.03％～10.6％［13］，而对于苯系物（BTEX，苯、甲苯、乙基苯、二甲苯）提取水平在1％～20％之间［14］，所以萃取过程基本不改变样本基体的状况，因此十分适合进行活体分析［15］。

对于非活体测定过程中扩散系数较小的目标化合物，若要增加萃取率，可以用纤维对同一样品反复进行萃取和解吸操作，并通过降低分析柱的温度至低于分析物的沸点，而使分析物保留在柱头，当然，这会令分析时间成倍增加。多次萃取得到的萃取量可用下式计算，其中i为测定的次数：

　　 （3-3） 　　

若以F表示多次萃取的全程回收率，也可以在预定回收率F的情况下，计算萃取所需的次数j，如公式（3-4）所示：

j=lg（1/F）/lg（KfsVf/Vs+1）　　（3-4）

对于包括固定相、顶空气相和液体样品三相同时存在的顶空萃取体系，萃取时质量传递的动力学过程包括了分析物从液相向顶空气相的迁移以及最终向涂层的迁移，因此相对于上面讨论的萃取体系，还要考虑分析物在顶空与液相之间的分配。顶空萃取系统达到平衡后，涂层中待测物的浓度可按下式计算［16］：

n=c0VfVsK1K2/（K1K2Vf+K2Vg+Vs）　　（3-5）

式中，c0为待测物初始浓度；Vf、Vs、Vg分别为涂层、样品和顶空的体积；K1、K2分别为待测物在涂层与顶空气相之间的分配系数和在气液（或气固）两相间的分配系数，即涂层、样品和顶空中分析物的平衡浓度比：K1=。若以K表示涂层与样品间总的分配系数，那么K=KH/KF=K1K2，其中KF、KH分别为待测物在涂层和样品基质中的亨利常数。那么式（3-5）就可以写为：

n=c0VfVsK/（KVf+K2Vg+Vs）　　（3-6）

式（3-6）给出了顶空SPME中，在各相中都达到平衡时聚合物涂层吸附的分析物的量，其中的K值接近于Kow值，而K2=KH/RT，Kow和KH值均可从相关文献查得，所以从上式就能够了解顶空SPME法是否适用于待测化合物。对于大多数化合物，K2值都较小，例如苯的K2值只有0.26，所以当顶空气相的体积远小于液体样品的体积（Vg≪Vs）时，顶空萃取法测定的检测限与直接萃取法是相近的。

二、影响萃取效率的因素及提高萃取效率的方法

纤维固相微萃取方法测定样品时，萃取量不仅取决于纤维涂层的极性和厚度，还与萃取方式、水样与顶空气相的体积、萃取时间、搅拌条件、萃取温度、pH值、无机盐的浓度和解析条件等诸多因素有关，所以用该方法分析样品时，必须严格控制测定条件，使之与测定校正曲线时完全相同。其中一些参数经过优化，可以有效提高萃取效率。

1.纤维SPME萃取方式的选择

应用纤维SPME技术萃取目标化合物可以使用3种萃取方式：①直接浸入式萃取（Direct Immersion，DI-SPME）；②顶空萃取（Headspace，HSSPME）；③膜保护萃取，三种萃取方式如图3-4所示。

直接浸入式萃取是把纤维插入到样品中，待测物从样品基体直接迁移到萃取纤维上，适于分析气体样品和洁净水样中的有机化合物，但不适于复杂样品基体中有机化合物的分析测定。

目前大部分有机化合物的萃取都选用直接法，尤其是针对水样中挥发性差的化合物，直接萃取时萃取头与分析物直接接触，较顶空法更好。对于气体样品，空气的自然流动可使易挥发的化合物快速达到平衡，但对于液体样品，纤维涂层外围会形成一个稳定的薄液层，阻碍目标化合物向涂层的扩散迁移，因此某种形式的搅拌十分必要。应用直接萃取法测定液体样品的缺点是纤维与样品基质的接触会大大缩短纤维的使用寿命。

顶空萃取是将纤维暴露于密封样品上方的气相中，萃取挥发到固体或液体样品顶空中的待测物，适用于分析废水、油脂、腐殖酸等复杂基体的样品和固体样品中挥发、半挥发性有机化合物。相对于直接萃取法，顶空法对扩散系数较大的挥发性物质，更具有优势。因为部分待测物在萃取之前就已进入顶空气相；在这里，待测物的扩散系数比在液相中高4个数量级［16］，通过机械方法不断更新气液两相的界面，能够使分析物更有效地吸附到纤维上，因此大大缩短了平衡所需时间。例如，对于水中的BTEX，取样时间可从直接法的5min缩短到顶空法的1min，检测限达到10-9级。另外，顶空萃取法中，纤维不直接接触样品，避免了基质的干扰，方法的重现性也优于直接法。

作为最常用的两种萃取方式，选择顶空法还是直接法，对方法的灵敏度没有影响，而是要根据目标化合物的性质确定。因为对于由液体及其顶空气相组成的体系，纤维萃取的待测物数量与样品中化合物的浓度密切相关，无论纤维是在液体还是在气体中，都与纤维所在的位置无关。只有当直接法用于萃取极易挥发的化合物，而该体系又没有顶空气相时，其灵敏度才和顶空萃取不同［17］。

膜保护萃取适用于污染严重的水样。纤维通过一个选择性的膜与样品隔离。待测物可以通过选择性膜吸附到纤维上，而样品中高分子量的化合物不能通过，从而排除基体干扰。与顶空萃取不同的是，膜保护法可用于不易挥发性化合物的分析。但由于待测物先要扩散穿过膜，才能吸附到涂层上，所以萃取时间较长。为缩短萃取时间可以使用较薄的膜和升高样品温度。

2.纤维涂层的选择

纤维涂层的性质直接影响萃取的效率和选择性。萃取时，选用涂有何种固定相的萃取纤维，应当综合考虑分析组分的极性、沸点及其在各相中的分配系数，但最基本的依据是“相似相溶”的原则。在现有的商品化纤维中，涂有聚二甲基硅氧烷（PDMS）非极性涂层的纤维，因其涂层面积较大，能耐受300℃的进样口温度，应用最为广泛，对许多非极性和弱极性的化合物均具有很好的萃取效率［18，19］。而涂有聚丙烯酸酯（PA）极性涂层的纤维，多应用于极性化合物如酚类、醇类的分析，但由于化合物在PA涂层中的扩散系数小于PDMS涂层，所需的萃取时间也比较长［20，21］。其他几种复合涂层中两种固定相的性质互补，分配系数明显大于单纯的PDMS涂层。带有二乙烯基苯（DVB）的复合涂层含有很多微孔，使固定相上的吸附和分配作用相互加强，大大增加了萃取的容量，同时这种微孔结构可从一定程度上对分析物的分子量进行识别，增强了纤维的选择性，PDMS/DVB，CAR/DVB，CW/DVB多用于萃取低分子量的挥发性化合物和极性化合物。两性涂层PDMS/CAR则是为了分析高挥发性的溶剂和气体设计的，它比PDMS涂层的纤维表现出更好的萃取效率，但重现性较差，所需平衡时间也较长。

此外，涂层的厚度对萃取的效率和萃取所需的时间也有一定的影响。从SPME的原理可知，增加涂层的厚度可以增大石英纤维涂层的体积，提高吸附量、降低检测限，但厚的涂层在萃取过程中需要较长的平衡时间。不同厚度的涂层适用的分析对象也不同，薄的涂层适合于萃取分子量大或半挥发性物质，而厚的涂层则适于易挥发性和分子量小的化合物。表3-2中比较了不同厚度的PDMS涂层对不同分子量的化合物的回收率，从中可以清楚地看出这一趋势。商品化纤维的涂层，性质较为稳定，厚度也能很好地加以控制，具有良好的重现性和重复性，同一根纤维测定化合物的相对标准偏差范围在3％～9％之间［22］。对于具有同一涂层类型的纤维，萃取的重复性与固定相的厚度有关，一般涂层厚的纤维，重复性比较好。

在与液相色谱联用的分析中，纤维的选择还要考虑更多的问题，例如解吸采用的模式，在此过程中流速的改变以及涂层在流动相中的溶胀性等。因此，可用于液相色谱分析的萃取纤维种类比可用于气相色谱的少得多，只有5种。

3.试样量、容器体积和顶空体积的选择

为保证萃取的效果需要对试样量、试样容器的体积进行选择，从SPME的原理可知，纤维萃取量增加不能单纯依靠样品体积的增加。样品浓度低时，平衡与浓度无关，因此样品体积的增加对提高萃取量没有帮助；样品浓度高时，体积的变化对萃取量就有很大的影响。高浓度的样品，在萃取之后，试样中分析物的减少不足以改变基体的浓度，其校正曲线往往呈现指数关系，而低浓度的样品，校正曲线则呈线性关系，利于测定的进行，所以在样品浓度范围未知的情况下，应尽量少地取用试样。若用直接法测定，还应使体系的顶空体积最小［24］。

对于顶空萃取法，分析的灵敏度还与样品体积和顶空体积之间的相互关系有关。Denis在利用顶空法检测14种半挥发性有机氯农药的研究中指出，试样量与容器体积之间存在匹配关系，试样量增大，重现性明显变好，检出量也提高了［25］。但我们的顶空萃取实验表明，当萃取容器体积一定时，同一浓度的样品体积增加，会使相应的顶空体积减小，纤维的萃取量随着顶空体积与样品体积比例的减少呈现先增加后降低的趋势，也就是说，顶空萃取时存在一个适宜的顶空-样品体积比。

4.反应温度的影响

SPME萃取过程中，分配系数与温度密切相关。应用一般的加热方式或微波加热方式［26］适当升高液体样品的温度，可加快分子运动速度，从而加快分析物的扩散速度，有利于分析物向纤维涂层的迁移，并可大大缩短萃取相与水相之间平衡的时间。特别是对于顶空SPME法，温度的升高，不仅能使待测物分子在水相中的运动速率加快，提高其挥发度，促进分析物向顶空气相的迁移，还能增加气相的蒸气压，加快气相中分子的碰撞速度，尤其能使固体试样中的组分尽快释放出来，提高分析的灵敏度。

但纤维的吸附又是一个放热过程，过高的温度会使待测组分在涂层与顶空间的分配系数下降，导致涂层对分析物的吸附能力降低，从而直接引起检测灵敏度的下降［27］。而且在顶空实验中我们还发现，水样温度升高后，水分子也会挥发到气相中并在温度较低的气相中凝结，形成小水滴附着在纤维上，影响后续的色谱分析。文献报道，气相中的相对湿度达到90％时，可使化合物的吸附量减少10％［28］。所以，在实际操作中往往需要选择一个最佳萃取温度。尤其是进行多组分同时测定时，由于各化合物的极性和挥发性的不同，所需的最佳温度也会有所差异，这就要依靠温度-萃取量的关系曲线来进行选择。

为了提高萃取效率，有科研工作者曾对SPME的装置进行了改造，在纤维外侧再加一层套管，管内通过液态CO2降低涂层的温度，使通过高温手段促使气相中分析物浓度加大的同时，不影响涂层的吸附能力［29］，取得了良好的分析结果。

对有些试样如土壤样品，由于分析组分与基质之间的结合力非常强，单纯升高温度并不能有效地释放分析组分，需要多种手段综合使用，提高检测灵敏度。

5.体系盐度的影响

向液体样品中加入无机盐（NaCl、Na2SO4）可增加溶液离子强度，降低有机物的溶解度，即盐析作用，使纤维涂层能吸附更多的分析组分，提高萃取效率［30］。但加入无机盐的量需要根据具体试样和分析组分来定，如Boyd-Boland在对22种含氮杀虫剂检验中发现，在基体中加入氯化钠可使多数组分的萃取效率明显提高，但对恶草灵、乙氧氟甲草醚等农药却无效［20］。另外，对有些化合物，当体系盐浓度过高时，盐溶作用会占有优势，此时纤维的萃取量反而减少了。

值得注意的是，样品溶液中加入盐，再用纤维直接萃取，测定后需仔细清洗纤维，因为纤维浸过盐溶液后变脆，极易折断。

6.体系酸度的影响

由于涂层固定相属于非离子型聚合物，对于吸附中性物质更有效。所以为了防止液体试样中待测物质的离子化，提高被吸附的能力，还需要调节溶液的pH值，以改变分析组分与样品介质、固定相之间的分配系数。尤其是对弱酸性和弱碱性化合物，样品的pH值直接影响其存在形态，因此应用适当的缓冲溶液调节pH值十分必要。在酸度调节时还应注意到pH对纤维的影响，在pH<1时，PA涂层不稳定。

7.加入溶剂的影响

向液体样品中加入溶剂会减少纤维上萃取的分析物的量［22，31］，但向固体或污水样品中加入有机溶剂，可以加速分析物向纤维涂层的扩散迁移［4］，从而提高萃取的化合物的量。适量的水或其他表面活性物质也将有助于固体样品中结合力强的分析组分的释放［32，33］。

8.基体搅动状态与萃取的时间

样品中分析物的萃取速度由其向涂层的质量传递决定，这个过程包括目标化合物在气体或液体样品中的对流迁移，以及样品中存在颗粒物时，分析物从固体表面的解析，和分析物在涂层中的扩散。当质量传递只取决于分析物在涂层中的扩散时，薄薄的涂层可使萃取过程很快达到平衡，通常小于1min［14］。但这种理想状态只能在气体样品的分析中才能得到。对于液体样品，分析物在迁移到纤维涂层上之前，必须通过液体样品与涂层之间形成的一个稳定的薄液层，因此延长了萃取所需的时间。薄液层很难消除，只有通过强烈而有效的搅拌才能促使扩散慢的化合物加速穿过，迁移到更接近纤维的地方，减弱其造成的干扰。而且通过搅拌还可使水样中的有机物分子分布更为均一，更快达到分配平衡，提高萃取效率。

一般可采用的搅拌技术有：样品的快速流动、纤维或容器的快速移动、搅拌或者超声振荡等。使用超声头对样品进行超声振荡较一般的磁力搅拌更有助于分析组分吸附到纤维上，所需的萃取时间更短。但由于磁力搅拌所用设备简单，目前的分析仍多使用此法。

为保证试验结果重现性良好，试验中应保持萃取时间一定，即从纤维一暴露在样品中，到萃取过程结束所需要的时间应在多次测定中保持一致。由于平衡时间与众多因素有关，因此实际萃取时间可由萃取量随萃取时间的变化曲线来选择。萃取开始时，待测组分很容易而且很快富集到纤维涂层中，使纤维的吸附量迅速增加，接近平衡时，吸附量变化趋于平缓，此时再延长萃取时间对富集也毫无意义了。拥有这种变化趋势的化合物，只要在其萃取平衡的时段内，对萃取时间的控制要求并不十分严格。多数化合物的萃取时间应控制在5～60min以内，顶空萃取所需时间比直接萃取少，几分钟即可使萃取量与原始浓度的比值达到最大。而直接萃取，特别是某些极性分子（如脂肪酸、农药等）与水分子作用力较强，在水中扩散较慢，萃取时间多为30min以上。

对萃取时间很长或本来就是一个非平衡态的反应体系，其萃取时间很难确定。根据非平衡理论［11］，萃取到纤维上的化合物量可用式（3-7）计算：

　　 （3-7） 　　

式中，K为分析物在样品和涂层之间的平衡常数；A为涂层的表面积；m1、m2分别为分析物在样品和固定相中的质量转移系数。

从式（3-7）以及前文的平衡理论可知，即使未达到平衡，纤维萃取的化合物量与其在样品中的浓度也存在比例关系，因此并不一定要选择达到完全平衡的状态，只要在确定萃取时间之后，严格控制萃取时间并使每次测定均保持一致，即可确保测定的精密度。

9.解吸条件

现代的气相色谱都允许SPME直接进样并完成热解吸，由于无溶剂使用，进样口通常设为不分流方式，并使载气保持较高的线性流速，这可防止峰展宽。此外有效的热解吸还取决于化合物的挥发性、涂层的厚度、进样的深度、进样口温度和解吸的时间。

调节进样口的温度可以明显促进解吸效率的提高。而且，适当的解吸温度还可使测定后纤维上的残留物最少，残留主要归因于杂质与聚合物涂层的强亲和力。有研究人员注意到SPME纤维上的残留就是由于解吸不完全所致［34］。多数化合物的解吸温度设置在150～250℃之间，往往稍高于它的沸点，目的是保持分析物的热稳定性，并在此前提下达到完全解吸。对难解吸的化合物，解吸温度要求更高，如农药需要300℃的高温才能有效解吸。对含有高温易分解化合物样品，可在进样口采用程序升温的方式。例如水中碘化合物的测定，因为温度大于150℃时CHI3会分解，所以进样口采用升温速度为5℃/min的方式从120℃→200℃或25℃/min的速度从150℃→200℃解析分析物，既可保证CHI3不发生热解，又可保证其他极性分析物的正常解吸［35］。为了进一步加快分析速度，还可应用其他解吸方式，如使用由热脉冲加热而非持续加热的汽化室，使用装有内热装置的萃取纤维，以及利用金属作萃取纤维通过加电压后的瞬时短路来高温解吸或使用激光脉冲加热解吸［36］等。

纤维插入进样口的深度对解吸的效率和柱分离的效果也有巨大影响。在分析过程中GC的进样口温度与柱温是不同的，致使进样口内存在温度差异，所以纤维插入的深度应调节到进样口的高温区或中心处。如果纤维在进样口中的位置温度较低，目标化合物的解吸速度慢，使进入分离柱的样品分子分散，就会造成色谱峰变宽，如图3-5所示。因此纤维插入进样口的位置也要经过优化实验加以确定。

纤维还需在进样口中停留一段时间，使分析物完全解吸下来，解吸的难易程度取决于分析物与纤维涂层的作用力大小和进样口的温度。一般2～5min即可使分析物完全解吸。实际上，许多挥发性化合物的解吸只需要1s，稍长的时间设置是为了去除纤维的残留。

用SPME-HPLC接口解吸可以采用两种方式：动态解吸和静态解吸。动态解吸中，纤维先插入接口，六通阀扳至“Injection”位置，化合物即被流动相冲洗下来，并直接进入色谱柱进行分离；静态解吸多用于牢固吸附在纤维上难以解吸的化合物，即先在接口中充满流动相或其他解吸溶剂，再将纤维插入接口浸泡一段时间，使化合物解吸进入溶剂中，再将六通阀扳至“Injection”位置，使分析物和溶剂进柱分离。无论使用哪种方式，使用最少量的溶剂对优化条件十分重要。

10.衍生化反应

针对强极性、难挥发的化合物，可使用衍生的方法，增加挥发性，降低极性，使其更易被固定相吸附，这样可有效增加萃取的效率、选择性，也利于后续的色谱分析，已经有很多化合物的测定中使用了衍生反应［37～39］。固相微萃取中普遍使用的有三种衍生方式，即原位衍生法、纤维上衍生法和进样口内衍生法。原位衍生法是指将衍生试剂加入待测样品中进行衍生反应，之后再用SPME纤维萃取衍生产物。这一方法已经用于水中苯酚的测定，通过衍生反应将其转变为醋酸盐可得到满意的结果［6］。

纤维上衍生又有两种方式。其一是将衍生用于萃取过程之后，即先将纤维暴露在样品或样品顶空中萃取分析物，再将吸附了分析物的纤维暴露在衍生试剂中一段时间，使分析物转变为相应的衍生产物。Okeyo等用85μm PA纤维，于室温下顶空萃取血清中的类固醇，30min后，再将纤维暴露于纯的衍生试剂（BSTFA）蒸气中，60℃顶空衍生1h，成功地萃取分离了六种类固醇［40］。另一种则是将衍生用于萃取过程之前，即将萃取纤维浸入衍生试剂中，待涂层中吸附了一定量的衍生试剂后再进行SPME萃取，这时在纤维涂层上萃取过程和衍生化反应同时进行。由于分析物一旦被萃取，就会发生衍生反应，所以这并非一平衡过程。由于此方法具有较高的萃取效率，易于进行现场采样分析，最具发展潜力，但对挥发性低的化合物具有一定的局限性。有人用溴化五氟苯甲烷或重氮化五氟苯乙烷对短链脂肪酸进行纤维上衍生化，用季铵碱和季铵盐对长链脂肪酸进行衍生化，顶空SPME法测定了水样和粪便中的脂肪酸［41，42］。

SPME纤维萃取化合物之后进入色谱仪，也可以在进样口内进行衍生反应。Nagasawa［43］等用此方法测定了安非他明，在SPME萃取后，通过向进样口注入衍生试剂，使之转化为氨基衍生产物，得以测定。