第五节　固相萃取的理论及方法开发

一、固相萃取的理论

（一）穿透体积及其理论预测

固相萃取的过程可以看作一个简单的色谱过程，萃取吸附剂就是固定相。在反相固相萃取中的上样过程中，流动相就是样品溶液中的水；而在洗脱过程中，流动相就是洗脱剂（大多数情况是有机溶剂）。因此进行反相固相萃取时，可用有关色谱理论预测指导萃取实践以减少盲目性。反相固相萃取的萃取对象一般为水样中的有机化合物，按有关色谱理论，反相萃取过程中，由于水是一个极弱的溶剂，此时水样中的有机化合物的保留因子k极大，因此被测物被强烈保留在反相吸附剂上而与大量的水样基体分离；洗脱时则使用了溶剂强度大的有机溶剂，此时被测物的保留因子k极小，因此被吸附剂吸附的被测物被定量洗脱，通过此吸附-洗脱的循环过程，达到对分析物的富集及纯化的目的。因此，为了取得好的萃取效果，在萃取过程中，我们希望保留因子k越大越好；而在洗脱过程中，我们希望保留因子k越小越好。

在色谱过程中，注射样品后，即在流动相的推动下连续不断地向柱末端流动并最终流出色谱柱，如果在此过程中在色谱柱末端接一对被测物有响应的检测器，则检测器对分析物的响应轮廓线必为一呈正态分布的峰型曲线。该曲线的拐点即为分析物的保留体积VR，其与分析物的保留因子k之间的关系为：

VR=V0（1+k）

式中，V0为色谱柱及检测器的死体积。

而固相萃取过程则与色谱过程稍有不同，样品溶液本身就是流动相，其流出曲线的轮廓线在达到最大后并不像色谱流出线那样逐渐下降，而是维持最大不变，这是由于样品溶液在不断地流入固相萃取柱。图2-21是一个典型的固相萃取流出曲线即穿透曲线示意图。图中VB即为该萃取柱的理论穿透体积，其含义是漏出的分析物浓度是原溶液中分析物浓度的1％时样品溶液的总流出体积；VM的含义是漏出的分析物浓度是原溶液分析物浓度的99％时样品溶液的总流出体积，此时流出液在组成上基本与原溶液一样。V0含义与色谱中一样，其与分析物保留因子的关系仍然是：

VR=V0（1+k）　　（2-1）

式中的V0项即固相萃取柱或盘的死体积，其值可由吸附剂的空隙率（ε）和固定相的床体积Vc进行估算。它们之间的关系是：

V0=Vcε　　（2-2）

而在固相萃取的萃取阶段，我们希望被分析物得到定量吸附，即在萃取阶段被分析物不要发生穿透，也就是用固相萃取处理的最大样品体积应不超过穿透体积VB。因此在固相萃取中，我们更感兴趣的是穿透体积VB，其与保留体积VR之间的关系是：

VB=VR-2.3σ　　（2-3）

式中，σ是标准偏差，其值取决于溶质在萃取柱中的轴向扩散，属动力学因素。因此穿透体积VB由热力学因素和动力学因素共同决定。标准偏差σ与柱的理论塔板数之间存在如下关系：

σ=（V0/N1/2）（1+k）　　（2-4）

结合以上各公式可得：

VB=（1+k）（1-2.3/N 1/2）V0　　（2-5）

由式（2-5）可知，一个化合物的保留因子越大，穿透体积越大；使用的固相萃取柱的理论塔板数越大，柱效越高，穿透体积越大。式（2-5）中k和V0易于查到或计算得到，N不易得到，一般通过估计得到一个大约值，一般典型的商品固相萃取柱的理论塔板数为20左右，通过公式（2-5），从理论上即可估算穿透体积。例如，现有一C18填充固相萃取柱的柱床体积为0.75cm3，大多数反相填料的空隙率（ε）值在0.65～0.70之间，若以0.70计算，则此固相萃取柱的死体积V0为0.75×0.70=0.525cm3，若一化合物的保留因子为3000，假设该萃取柱的理论塔板数为20，则可由式（2-5）计算得该体系的穿透体积为765mL。

（二）穿透体积的实验测定

根据式（2-5）计算得到的穿透体积只是一个大约值，在具体工作中，穿透体积大多是通过实验的方法来进行测定的。穿透体积的实验测定可按下述几种方法进行：

①最简单的测定穿透体积的方法是直接法，即以合适的恒定流速使一样品溶液流过固相萃取柱，在固相萃取柱的出口处安装一检测器，使其连续检测出口处被分析物的浓度，根据测定数据作出穿透曲线，从该曲线直接得到穿透体积，这就是直接法。该测定方法要求检测器必须有高的灵敏度，否则固相萃取柱流出液中的被分析物浓度很难测定准确；另外，测定时溶液浓度必须合适，浓度过大会造成萃取柱的过载。穿透体积的大小还与溶液的流速有关，测定穿透体积时一般要求流速尽可能与实际测定样品时的流速一致。直接法的另一个缺点是测定过程很长费时间。

②为了提高测定的速度，人们又提出了另一种测定穿透体积的方法，该方法既可按在线方式进行，又可按离线方式进行。该方法首先用固相萃取柱浓缩一系列体积不断增大但含有相同质量被分析物的溶液，然后洗脱被吸附的分析物，再用色谱仪测定洗脱液的峰高及峰面积。随着溶液体积的不断增大，分析物浓度逐渐降低，但只要固相萃取柱不发生穿透，则被固相萃取柱保留的溶质总量及随后的洗脱液的浓度就保持不变，这样上述一系列不同体积的溶液在色谱测定中得到的色谱图及峰面积均应相同。当穿透发生后，随着溶液体积的不断增大，被固相萃取柱萃取的被分析物的质量不断减少，则随后的色谱测定中的峰高及峰面积不断降低，最后作峰面积-样品体积图，从该图就可得到穿透体积。这种方法的优点是可以同时测定几种化合物的穿透体积，并且该测定是在与未知样品相同的实验条件下完成的。

二、固相萃取的方法开发

（一）固相萃取的类型

固相萃取在基本原理上与液相色谱类似，因而按萃取原理固相萃取也可分为反相固相萃取（Reversed phase SPE）、正相固相萃取（Normal phase SPE）、离子交换固相萃取（Ion exchange SPE）等。

反相固相萃取是目前最为常用的一种固相萃取方法，其基本含义是使用非极性的疏水性固定相如C18键合硅胶、C8键合硅胶、聚苯乙烯-聚二乙烯苯共聚物固定相、碳分子筛、石墨化炭黑等从极性的样品溶液如水样中萃取非极性或弱极性的分析物，定量萃取分析物后，再用少量有机溶剂将分析物从固定相上洗脱下来进行测定。

与反相固相萃取相反，正相固相萃取的目的是从非极性的样品溶液中萃取相对极性的分析物，在该萃取体系中一般使用极性较大的固定相如硅胶、氧化铝、氧化镁及硅镁型吸附剂等。分析物被定量吸附后再用少量极性较大的有机溶剂将分析物从固定相上洗脱下来进行检测。该类固相萃取很少用于直接萃取非极性溶液中的极性成分，绝大部分使用在水溶液等样品中有机提取物的去杂净化。例如，测定植物样品或动物样品中多环芳烃或多氯联苯时，一般是先将样品用环己烷充分浸提，分析物被萃取进入环己烷相，而在此过程中原样品中的植物油及动物脂肪也有相当比例进入环己烷相，植物油及动物脂肪的存在会干扰后续的气相色谱测定。因此，在进行气相色谱测定前必须对该环己烷提取物进行纯化，其方法是将此环己烷提取物溶液通过填充有硅镁型吸附剂的固相萃取柱，则分析物及溶液将流过该柱，而植物油及动物脂肪将被吸附在固相萃取柱上，这样可达到纯化提取物的目的。又例如测定贝壳等软体动物组织中有机锡时，首先将动物组织匀浆，用少量盐酸-四氢呋喃酸化样品后，加入适量艹卓酚酮-正己烷，在振荡仪上充分振荡以浸提样品中的有机锡，离心分离，取上层清液并转移至旋转蒸发仪中，蒸发至1～2mL，加入格氏试剂，充分振荡使样品中的离子型有机锡定量转化为非离子型的疏水性衍生物，此时该正己烷溶液中除含有有机锡的衍生物外，还含有较大量的动物脂肪，脂肪的存在会干扰有机锡的色谱测定，测定前应采用正相固相萃取法可除去该溶液中的脂肪，其做法是：将该溶液通过填充有硅镁型吸附剂的固相萃取柱，溶液中的脂肪将被吸附在吸附剂上，而分析物有机锡的衍生物将通过该柱，收集过柱液后用气相色谱法测定即可。

当分析物为离子状态时，则可考虑选择含有阳离子或阴离子官能团的固定相来萃取此类分析物。进行此类萃取时，应注意选择合适的pH值以使分析物在上样萃取阶段以离子状态存在，从而达到定量吸附；在洗脱时则应选择合适的有机溶剂并调节其pH为合适数值，以使分析物转化为中性的分子状态，从而被该有机溶剂定量洗脱。除此之外，还可采用另外一种较高浓度或与固定相亲和能力更大的离子溶液来将分析物置换洗脱下来。

了解了固相萃取的几种类型，在具体工作中，就可根据样品的类型、分析物及主要基体的性质，选择合适的固相萃取类型，确定了固相萃取类型后，再选择合适的固定相、上样溶剂、淋洗溶剂和洗脱溶剂。溶剂选择最重要的因素是溶剂强度，它是保证固相萃取成功的关键。表2-6列出了正、反相固相萃取中常见溶剂强度的大小关系。

（二）吸附剂的选择

选择固相萃取固定相时，考虑的因素主要是：需要萃取的分析物的性质和样品溶液的基体，即溶剂。

被分析物的极性与固定相的极性越相似，两者之间的作用力越强，分析物在该固定相上的保留越完全，因此在进行固相萃取时，应尽可能选择与被分析物极性相似的固定相。例如，萃取低极性的碳氢化合物、多环芳烃、多氯联苯等物质时，应选用低极性的反相固定相如C18键合硅胶、乙烯-苯乙烯共聚物、碳分子筛等。而萃取中等极性的物质时，正、反相固定相都可使用。

另外，选择固定相时还应考虑样品溶液的溶剂强度。样品溶液的溶剂强度相对于固定相应该较弱，溶剂强度较弱时，被分析物的保留因子较大，则被分析物在固定相上必有强的吸附保留。如果溶剂强度太大，分析物的保留必然很弱或不被保留。例如，样品为水溶液时，应用反相固相萃取法，不应使用正相固相萃取法，此时应选用C18键合硅胶等反相填料，而不能用极性大的正相填料，原因是在反相固相萃取法中，水是一个溶剂强度极弱的溶剂，使用它不会影响分析物的保留。样品溶剂是正己烷时，则应选用正相填料；此时选用反相填料就很不合适，原因是对反相固相萃取来说，正己烷是一个溶剂强度很大的溶剂，如果此时使用C18键合硅胶等反相填料作为固定相，则分析物不会保留或保留极少。

选择固定相时还应注意的其他事项包括：分析物是否能离子化，能否使用离子交换固定相；分析物在各种溶剂中的溶解度；干扰组分是否与分析物竞争固定相上的结合位点等。

（三）洗脱剂的选择

固相萃取的过程实际是一个简单的液固色谱过程，它包括四个基本过程：固定相的活化、上样富集、淋洗杂质、分析物洗脱均涉及溶剂的选择问题。既然固相萃取过程是一个色谱过程，那么在选择溶剂时，可借用有关的色谱理论来进行指导。

1.固定相活化时溶剂的选择

固定相的活化要达到的目的有两个：去除固定相上的杂质；使填料被溶剂润湿并溶剂化，从而提高分析物的回收率及测定的重现性。所以活化固定相时一般使用两个溶剂，第一个溶剂（初溶剂）用于净化固定相；第二个溶剂（终溶剂）主要作用是使固定相溶剂化，即用于建立一个合适的固定相环境以便使样品中的分析物得以保留。每一个活化溶剂的用量一般为每100mg固定相1～2mL活化溶剂。

不管是商品固相萃取柱还是自制的固相萃取柱，或多或少都含有杂质，因此都必须用一种合适的溶剂（初溶剂）去除这些杂质，杂质去除不彻底将会导致对分析物测定的严重干扰，从而造成分析误差。例如对最常使用的C18键合硅胶，一般使用的初溶剂为甲醇，甲醇可有效地去除该固定相上所含有的杂质。

选择终溶剂时最重要的一点是其溶剂强度应与样品溶液的溶剂强度一致，若使用太强的溶剂，会导致分析物回收率的下降。如用C18键合硅胶萃取水样中疏水性有机物时，理想的终溶剂应是蒸馏水，而且还应将此蒸馏水的pH及其他成分调节至与实际水样尽可能一致。

固定相在活化过程和活化结束后，都不能将活化溶剂抽干。否则将会使填料干裂和进入气泡，这将导致柱效的降低，将造成回收率低和重现性差的结果。

2.上样萃取时溶剂的选择

为了使分析物得到好的保留，上样萃取时应采用尽可能弱的溶剂。如果上样溶剂强度太大，分析物将不被保留或保留很弱，这样测定时分析物的穿透体积将很小，回收率将很低。如果上样时溶剂选择合适，分析物必然得到好的保留，这样一方面可保证测定有高的回收率，另一方面可得到大的穿透体积，从而可采用大的上样量，获得高的富集倍数。

3.淋洗去杂质溶剂的选择

分析物得到保留后，常需使用合适的溶剂淋洗固定相，其目的是洗掉吸附于固定相上的不需要的干扰组分。经过淋洗可得到更纯净的样品，这样可得到更简单理想的色谱图，有利于得到更正确的分析结果，也可以更好的保护色谱柱，从而延长色谱柱的使用寿命。因此淋洗溶剂强度的选择非常重要，其强度不能太高，也不能太低，即应大于或等于上样溶剂，小于洗脱溶剂，其最高目标应是：尽可能将干扰组分从固定相上洗脱完全，但又不会洗脱任何分析物。

4.洗脱溶剂的选择

选择理想的洗脱溶剂主要应该考虑以下两点。

（1）溶剂强度应足够大，即使用该溶剂时分析物的保留因子k应该尽可能小，这样可保证将吸附在固定相上的分析物定量洗脱下来。洗脱剂的用量一般为0.5～0.8mL/100mg固定相。对大多数化合物来说，乙腈是比甲醇及乙醇更好的洗脱溶剂。另外，对大多数化合物来说，它们在C18键合硅胶-有机溶剂体系中的保留行为与其在苯乙烯-二乙烯苯共聚物固定相-有机溶剂体系中的保留行为基本一致，但其在C18键合硅胶-有机溶剂体系中的保留因子比在苯乙烯-二乙烯苯共聚物固定相-有机溶剂体系中的保留因子要小一些。

（2）选择的洗脱溶剂应与后续的测定相适应，即要么该溶剂易于挥发，这样可在定量洗脱分析物后用氮气等惰性气体将该溶剂吹干，再用合适的另一种溶剂溶解分析物后，直接进样进行色谱测定；要么该溶剂适合于色谱分析，这样直接进样就可进行分析测定，蒸发及溶剂置换这一步骤就可省略。

另外还应注意所选溶剂的黏度、纯度、毒性、反应性及与检测器是否匹配（如液相色谱中紫外检测器的截止波长等）。在其他条件相同时，应该选择黏度低、纯度高、毒性小并与分析物及固定相不反应的溶剂。选用的溶剂的截止波长应小于分析物的检测波长，即溶剂不对分析物的检测产生干扰。选用单一溶剂洗脱效果不理想时，可考虑使用混合溶剂进行洗脱。